Resumo da metodologia

Os equipamentos, destinados à realização de PCR em tempo real, associam um termociclador a um leitor de fluorescência capaz de medir a luz proveniente de uma reacção de amplificação. A metodologia utiliza os mesmos reagentes de uma PCR convencional acrescido de fluorocromos, intercalados em cadeias de DNA (SybrGreen) ou presentes em sondas de hibridização específicas (sondas TaqMan). Na presença de produto amplificado, os fluorocromos, excitados por uma fonte de luz, emitem um sinal proporcional à quantidade de produto sintetizado que, por sua vez, será proporcional à quantidade inicial de sequencias-alvo presentes na reacção de amplificação. Os sinais são detectados por um sistema óptico e analisados por software específico. Os sinais de fluorescências, produzidos à medida que o produto é amplificado, são expressos graficamente (sinais de fluorescência versus número de ciclos) permitindo monitorar, em tempo real, a cinética e a eficiência da reacção de amplificação. 

	Passo 1: Preparação da reacção O fluorocromo Sybrgreen emite fluorescência quando ligado a DNA de cadeia dupla.
	Passo 2: Desnaturação Quando o DNA é desnaturado em DNA de cadeia única, o  fluorocromo Sybrgreen é libertado e a sua fluorescência é drasticamente reduzida.
	Passo 3: Polimerização Durante a extensão, os primers emparelham e o produto de PCR é formado
	Passo 4: Fim da Polimerização O fluorocromo Sybrgreen incorporado nos produtos de PCR formado excitado por uma fonte de luz emite sinal fluorescente

Os ciclos iniciais de amplificação, caracterizados por reduzidos incrementos nos sinais de fluorescência, definem o limiar de detecção. A metodologia permite monitorar, em tempo real, o momento da reacção em que a fluorescência emitida pelo produto amplificado ultrapassa o limiar de detecção (Cycle Threshold - CT). O ponto CT indica o momento a partir do qual a reacção se encontra na fase exponencial e o produto amplificado é quantificado.

A quantificação do produto amplificado é realizada através de comparação com uma curva padrão que correlaciona a intensidade dos sinais de fluorescência, gerados durante os ciclos de amplificação, com as concentrações conhecidas de uma sequência idêntica a que se quer quantificar. O PCR em tempo real é altamente sensível, sendo capaz de detectar até 10 cópias de DNA/mL. A especificidade da reacção é confirmada através de uma curva (Curva de Melting) quando utilizada a química SybrGreen, que indica o ponto correspondente à temperatura de dissociação do amplicão específico para as sequencias-alvo amplificadas.